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Articulos sobre Genética - Genómica veterinaria
Indice del artículo
Genómica Veterinaria
Genómica estructural
Genómica Funcional
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 GENÓMICA ESTRUCTURAL

 La genómica estructural pretende la caracterización física de los genomas completos: localización de los genes en los cromosomas, construcción de mapas genéticos, de mapas físicos y, en última instancia, la secuenciación completa del genoma.

Se puede considerar que la mayoría de los proyectos genómicos están aún en esta etapa de geonómica estructural.

En 1996 se publicó la primera secuencia completa de un organismo eucariota, el de la levadura Sacharomyces cerevisiae, un año antes se había publicado la primera secuencia de un organismo procariota, el Haemophilus influenzae. Con posterioridad, han ido apareciendo secuencias prácticamente completas de otros organismos muy utilizados como modelos en el análisis genético clásico, como el de la mosca del vinagre Drosophila melanogaster, el nematodo Caenorhabiditis elegans, la planta Arabidopsis thaliana y en el año 2001 se publicó un esquema que incluía aproximadamente el 90 % de la secuencia completa del genoma humano, con algunos años de adelanto sobre las previsiones iniciales.

  Otros organismos de interés en veterinaria, como bacterias, hongos o parásitos han recibido también la atención de la geonómica, fruto de la cual está previsto que en los próximos 2 años los genomas completos de unas 70 especies estarán disponibles.

  Muchos son los hitos que se pueden señalar como responsables del gran desarrollo actual de la geonómica, entre ellos señalaremos los que, a nuestro juicio, han tenido una mayor contribución inmediata al desarrollo de la geonómica estructural.

  En 1970, Daniel Nathans y Hamilton Smith descubrían un tipo especial de enzimas que cortaban el ADN en puntos que tenían una secuencia nucleotídica específica. Estas enzimas recibieron el nombre de endonucleasas de restricción o simplemente  enzimas de restricción, y a los puntos de corte reconocidos por estas enzimas dianas de restricción. Estas enzimas son producidas por bacterias como un mecanismo de defensa frente a los fagos, estando ausentes de la mayoría del resto de los seres vivos. Muchas de estas enzimas cortan el ADN de tal manera que se generan extremos cohesivos, que pueden formar puentes de hidrógeno, esto es, unirse con secuencias complementarias, independientemente del organismo del que provengan. Esta propiedad permite obtener quimeras de ADN, lo que no representa otra cosa que la posibilidad de construir ADN recombinante artificial. Esto fue lo que logró Paul Berg en 1972 después de aislar moléculas de ADN de distintos orígenes, cortarlos mediante enzimas de restricción y unirlos en un tubo de ensayo.

  La trascendencia de este hito radica en el hecho de que estos procedimientos constituyen la base de gran parte de la ingeniería genética actual.

 En 1977 se presentaron dos métodos diferentes que permitían determinar la secuencia nucleotídica del ADN, es decir, su secuenciación automática. Uno fue desarrollado por Allan Maxam y Walter Gilbert, y el otro, en la actualidad el método de elección, por Fred Sanger. A partir de estos métodos fue posible conocer la secuencia concreta de muchos de los genes descritos hasta entonces y en la actualidad continua siendo la técnica básica para llevar a cabo el objetivo último de la geonómica estructural.

 Uno de los avances más espectaculares para el desarrollo de la geonómica en los actuales niveles fue la técnica descrita por Kary Mullis en 1985 conocida como reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction) que permite replicar regiones concretas de una hebra de ADN generando un número muy elevado de copias del fragmento inicial. Esta técnica fue posible gracias al descubrimiento de una polimerasa termoestable (la polimerasa es una enzima que cataliza la polimerización de los nucleótidos) denominada Taq que es obtenida a partir de la bacteria Thermus aquaticus.

  Para obtener una copia in vitro de ADN es necesario proceder previamente a su desnaturalización (separación física de las dos hebras) mediante la aplicación de calor. Desnaturalizado el ADN es posible, después de haber bajado la temperatura, el inicio de su copia a partir de unos cebadores y de la mediación de la enzima polimerasa que permite la elongación en sentido convergente de la hebra de ADN copia a partir de esos cebadores. Una vez que la replicación del segmento delimitado por los cebadores se ha completado se procedería a desnaturalizar por el calor a las dos nuevas moléculas de ADN procediendo a un segundo ciclo tras bajar la temperatura y siempre que existan en el medio los componentes necesarios para la polimerización (dNTPs y Taq).

  Es fácil advertir las múltiples aplicaciones de esta técnica en cualquier laboratorio veterinario de genética molecular, algunas de las cuales veremos a continuación.

 El cuarto hito al que quisiéramos referirnos es el descubrimiento de los marcadores moleculares, a los que, por su especial relevancia en múltiples aplicaciones veterinarias, dedicaremos una especial atención.

Marcadores moleculares

 Los marcadores moleculares son fragmentos de ADN que sirven de referencia para seguir la transmisión de un segmento de cromosoma de una generación a otra. En un sentido restringido, un marcador genético es una entidad genética que manifiesta polimorfismo y se hereda de forma mendeliana. El interés por detectar variación molecular para diversas aplicaciones ha conducido a un enorme incremento en el tipo y número de marcadores disponibles para análisis genético.

  En un cromosoma estándar de un organismo eucariota, el centrómero, región que divide al cromosoma en dos brazos, es una zona rica en secuencias satélites cuyo ADN no se transcribe presentándose en forma de grandes bloques repetidos con una composición de bases, y por tanto una densidad, que puede diferir sustancialmente de la del resto de ADN celular. En las regiones teloméricas, los extremos del cromosoma, encontramos otro tipo de ADN repetido que sigue un patrón de repetición en forma de grandes bloques de ADN. Estas secuencias de ADN reciben el nombre de minisatélites.

  A lo largo de todo el cromosoma y con preferencia fuera del centrómero, encontramos otro tipo de ADN repetitivo que no se transcribe y cuya unidad de repetición es muy corta y recibe el nombre de secuencias microsatélites.

  Los genes están situados a lo largo de todo el cromosoma en regiones de cromatina más activas y que se caracterizan por ser poco receptivos a la tinción con Giemsa. 

 Tipos de marcadores

 Aunque ya en 1910 Landsteiner descubrió lo que pueden ser considerados como primeros marcadores genéticos, los grupos sanguíneos, a los que siguieron otros marcadores como los polimorfismos bioquímicos o las inmunoglobulinas del HLA (Human Leucocyte Antigen). El escaso número de variantes polimórficas limitó mucho el uso de esas herramientas en cualquiera de las diferentes aplicaciones en las que los marcadores han demostrado su utilidad. Por ello, estos marcadores dejaron de utilizarse a partir del momento en que se describieron los nuevos marcadores moleculares que vamos a comentar.

  • RFLPs o Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción:  El corte de ADN genómico por parte de una endonucleasa de restricción genera una serie de fragmentos cuya longitud está dictada por el reconocimiento de la secuencia de nucleótidos que conforman la diana. Los cambios nucleotídicos que afectan a estas dianas (haciéndolas aparecer o desaparecer) permiten detectar el polimorfismo entre dos individuos. Este polimorfismo se evidencia por migración del ADN fragmentado en un soporte físico sometido a un campo eléctrico.

  • RAPD o Polimorfismos de ADN amplificados al azar: En una PCR estándar, el acotamiento del fragmento, se realiza mediante dos cebadores diferentes que corresponden a la secuencia complementaria de cada una de las dos cromátidas de ADN. Este hecho conlleva la obligación de conocer la secuencia que se va a amplificar para poder diseñar los cebadores. Sin embargo, en los RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)los cebadores utilizados son especialmente cortos (10 bases) y se utilizan de forma individual en reacciones de PCR con un nivel de especificidad muy bajo. De esta forma se genera un patrón de bandas sencillo que dependerá de la capacidad de los cebadores para encontrar zonas parcial o totalmente complementarias que puedan acotar una secuencia corta. En función de la secuencia nucleotídica, la amplificación evidenciará el polimorfismo existente entre dos individuos, dando lugar o no a determinadas bandas.

  • AFLP o Polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados:  Los AFLPs (Amplified Fragment Length Polymorphism) o polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados constituyen un procedimiento patentado que se desarrolló en plantas hace unos doce años. Estos marcadores se consiguen utilizando tanto enzimas de restricción, al igual que en el procedimiento de los RFLP, como la reacción en cadena de la polimerasa. Como consecuencia, se generan unos patrones de bandas muy complejos en dónde es fácil encontrar polimorfismo.

  • STRs o microsatélites: En el año 1989 se identificaron los microsatélites al descubrirse que existían zonas del ADN no codificante que contenían repeticiones de mono, di, tri o tetranucleótidos un número variable de veces (entre 10 y 20 de media). Los microsatélites se llamaron primero VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) porque la unidad repetible estaba presente un número variable de veces. El término VNTR también incluía los minisatélites cuya unidad de repetición es más larga (de 100 a varios cientos de nucleótidos). La nomenclatura terminó dejando el término microsatélite o STR (Short Tandem Repeat) para los más cortos, y minisatélites o VNTR para los otros. Los microsatélites, por su densidad en el genoma, su facilidad de detección, su polimorfismo han sido desde su descubrimiento por Tautzt en 1989, los marcadores de elección y por tanto los más utilizados para muchas aplicaciones.

  •   SNP o Polimorfismos de un solo nucleótido: Los SNP (Single Nucleotide Polimorphism) son polimorfismos producidos por un cambio único cambio nucleotídico, cuya frecuencia oscila entre 1 de cada 600 y 1 de cada 1000 pb. La importancia de estos marcadores se ha visto magnificada a partir del momento en que la descripción de microsatélites, cuya densidad es mucho menor, ha resultado ser insuficiente cuando se trata de balizar una parte concreta del genoma con un número alto de marcadores.  La ventaja de los SNP es su facilidad de detección al ser loci dialélicos, por lo que el uso de ‘microarrays’ o ‘microchips’ de ADN se está generalizando, aumentando drásticamente la velocidad de detección y el volumen de análisis posible.

 Propiedades tecnológicas de los marcadores

La detección de los marcadores en el laboratorio puede realizarse sobre cualquier tejido del animal, y a cualquier edad, obteniéndose un genotipo que no se verá influido por el paso del tiempo ni por el ambiente. El nivel de información, facilidad y coste de detección de los marcadores varían dependiendo del tipo de marcador utilizado. Un marcador es más informativo cuanto más alelos tenga y cuanto más próximos a la equifrecuencia se encuentren esos alelos, y también es más informativo un marcador codominante (aquél en el que todos sus alelos pueden deducirse por la observación del fenotipo) que un marcador dominante en el que el alelo recesivo es  observable solamente en estado homocigoto.

 Aplicaciones de los marcadores

  Los marcadores moleculares son las herramientas básicas de muchas aplicaciones en genética animal. Comentaremos a continuación las más relevantes:

  Mapas genómicos

 Un mapa genómico es un mapa en el que todos los cromosomas están balizados con marcadores y con genes. Esto implica la elaboración previa de un mapa genético relacionando los diferentes loci entre sí independientemente de su localización cromosómica, que a su vez se ha establecido mediante técnicas que culminan en un mapa físico. Las mismas técnicas de localización genética y física se utilizan para la identificación de secuencias correspondientes a caracteres de interés,  denominados QTLs (Quantitative Trait Loci) o genes que afectan a caracteres de importancia económica. Por ello, hablaremos, aunque brevemente, del método más importante para el establecimiento de mapas genéticos, así como algunas de las técnicas usadas en los mapas físicos.

 

El primer paso para realizar un mapa genómico es la descripción de un número suficiente de marcadores moleculares; éstos se relacionan unos con otros basándose en la detección de ligamiento. Esta propiedad física permite deducir la posición de unas secuencias determinadas de ADN midiendo el número de veces en que se separan dos loci por recombinación meiótica. De esta manera, los distintos marcadores se pueden posicionar a lo largo de los cromosomas en grupos de ligamiento o sinténicos consiguiendo una densidad que permite en muchos casos localizar genes de interés en patología o producción por su ligamiento con determinados marcadores.

  El análisis de ligamiento es el método clásico que permite conocer la fracción de recombinación  mediante el estudio de la cosegregación de los marcadores con los de caracteres de interés, utilizando individuos que pertenecen a estructuras familiares (medios hermanos) o determinados tipos de cruzamientos (F2 o Retrocruzamiento).

  Este método está condicionado por la necesidad de disponer de individuos recombinantes y limitado, por lo tanto, por la densidad de los marcadores y el tamaño de familia. Permite resoluciones entre 1 y 30 cM, aunque en animales domésticos sea más preciso hablar de 20-30 cM.

  Mapas físicos

 Pero para muchas de las aplicaciones en geonómica se requiere un mayor grado de resolución que es posible lograr mediante la cartografía física de fragmentos de ADN.

Un mapa físico parte de la fragmentación de un genoma mediante una digestión parcial, generando fragmentos más abordables técnicamente con el objetivo de lograr un conjunto de clones solapados que cubran un cromosoma entero o el genoma completo de una especie.

  La ubicación en estos fragmentos de regiones conocidas de ADN (marcadores) permite solaparlos de manera que se puedan ir construyendo lo que se denominan contigs que se agrupan a su vez en unidades mayores hasta cubrir en cromosoma completamente.

 En la actualidad existen numerosas genotecas de YACs y BACs en las que los fragmentos correspondientes a un genoma están clonados (repetidos, multiplicados) respectivamente en cromosomas artificiales de levadura o de bacterias.

  Aplicaciones de los mapas genómicos

  Una de las aplicaciones más importantes de los mapas genómicos es la posibilidad que nos ofrecen para iniciar trabajos de localización de genes responsables de caracteres de interés. Las estrategias de ‘la caza’ de estos genes dependerán del tipo de carácter que nos interese, esto es, si se trata de un carácter mendeliano o complejo, y del nivel de conocimientos que tengamos sobre la biología del carácter o del modelo de herencia.

  Lo que llamamos caracteres mendelianos son caracteres de herencia simple generalmente determinados por un único gen.  Cuando la base biológica del carácter es conocida, por ejemplo cuando conocemos el producto (la proteína) que influye directamente sobre el carácter, podemos llegar hasta el gen responsable siguiendo la clásica secuencia: carácter-función-gen-mapa, esta es la denominada estrategia del clonado funcional.

  Otro método es el del gen candidato en el que se propone un gen determinado, basándose en el conocimiento que se tiene sobre su función, como el causante directo o indirecto de las modificaciones fenotípicas observadas. Además, la estrategia del clonado posicional puede resultar muy eficiente si previamente existe una región de ADN flanqueada por marcadores en la que supuestamente debería de situarse el gen. De esta manera se han identificado genes tan importantes como el gen hal, responsable del síndrome de estrés porcino o el gen mstn, asociado con la hipertrofia muscular bovina.

La mayoría de los caracteres productivos podrían, sin embargo, incluirse dentro de la categoría de caracteres complejos al estar determinados por varios genes con un efecto más o menos reducido. La posición de estos genes puede estimarse a partir del grado de ligamiento entre marcadores moleculares que se sitúan en sus flancos y los caracteres de interés, lo que permite su localización, estimación del efecto que produce sobre el carácter, y la posterior identificación de la secuencia responsable.

  Una estrategia general de localización de genes o QTLs se puede concebir en tres etapas:

  1.   En la primera etapa se hace una barrido genómico, por ejemplo mediante le genotipado de 300-400 marcadores distribuidos uniformemente por todo el genoma, utilizando técnicas clásicas de análisis de ligamiento tal y como comentamos anteriormente lo que permitiría la localización de la región o regiones de interés con una resolución de 20-30 cM.
  2.   En una segunda etapa se saturaría la región o regiones de interés con un elevado número de marcadores y se procedería a un análisis de desequilibrio de ligamiento (análisis de asociación). En este procedimiento el grado de ligamiento, es decir, la proximidad, se estima analizando la reducción que se produce con el paso del tiempo del nivel de desequilibrio de ligamiento. El análisis de asociación, a diferencia del análisis de ligamiento, permite incorporar individuos que no pertenecen a estructura familiar alguna e incrementar así la resolución hasta valores de 0,1-1 cM.
  3.   En la tercera etapa se procedería al clonado posicional antes mencionado obteniéndose la secuencia exacta del gen implicado en el fenotipo de interés Dos ejemplos característicos de esta estrategia en tres etapas lo constituyen la identificación del gen responsable de la fibrosis quística en el hombre y del gen responsable de la hipertrofia muscular en bovino, aunque en este último ejemplo la estrategia del gen candidato también contribuyó a su descubrimiento.

  La incorporación en los programas de mejora de la información que proporcionan los QTLs comienza a ser una realidad en especies de animales de renta como el porcino, y el bovino tanto de carne como lechero y se lleva a cabo mediante herramientas de genética cuantitativa, lo que se denomina la selección asistida por marcadores (MAS: Marker Assisted Selection). La selección asistida por marcadores se justificaría en el caso de la mejora de caracteres difíciles de medir, que manifiesten heredabilidades reducidas, que se expresen en un solo sexo o muy tarde en la vida de un animal y los esquemas de mejora  a diseñar necesitarían, para garantizar el éxito, la disponibilidad de técnicas avanzadas de reproducción asistida. En la actualidad su aplicación es todavía reducida y su eficiencia respecto a los programas clásicos dudosa ante la ausencia de genes identificados en el ámbito del conjunto de la población o debido a la existencia de complejas interacciones con otros genes.

  Identificación genética, trazabilidad y control genealógico

  Desde un estado muy temprano, el individuo posee un genoma estable para el que tendrá un determinado genotipo en los marcadores analizados. Este hecho permite hablar de lo que frecuentemente se ha denominado una huella genética que, como la huella dactilar de un individuo, es única y fácilmente evidenciable mediante técnicas moleculares lo que permite la identificación del individuo en todo momento y circunstancia. La trazabilidad es una de las consecuencias de la posibilidad de identificación individual que nos permite los marcadores moleculares. Este término se aplica a la posibilidad de identificar una muestra anónima y seguir su rastro hasta su origen. Las aplicaciones en veterinaria empiezan a ser importantes tanto para garantizar las características del ser vivo que ha dado lugar al producto elaborado, como para contrastar la presencia o ausencia de restos de animales o vegetales en productos elaborados.

 

Otra consecuencia inmediata de las posibilidades de identificación individual junto con la propiedad de herencia mendeliana de los marcadores moleculares es la posibilidad de llevar a cabo el control de filiación, lo que nos permitirá mantener la integridad de los libros genealógicos cuya fiabilidad es fundamental para llevar a cabo los programas de selección y mejora.


La potencia estadística que es posible hoy en cualquier especie de animal doméstico permite no sólo la exclusión de paternidad, también es posible la asignación de paternidad o, en general, la contrastación de cualquier otro tipo de parentesco.

  La diferencia genética entre poblaciones aisladas reproductivamente es posible ser detectada y, por ello también lo es asignar muestras anónimas a determinadas poblaciones.

  Estudios de diversidad genética

   Los marcadores moleculares constituyen una buena herramienta también para analizar la diversidad genética como medida de control de actuación de poblaciones, introducción de determinados genotipos, límites para la selección y medida del empobrecimiento de la variabilidad genética. Los proyectos de diversidad han recibido, en relación a los proyectos genoma, una considerable menor atención a pesar de tener una enorme trascendencia si tenemos en cuenta, por ejemplo, que desconocemos más del 99 %de las bacterias que hay en el suelo o en los océanos y que representan más de la mitad del carbono y una proporción significativa del fósforo de nuestro planeta.